Fast Probe qPCR Master Mix (2x) to uniwersalne rozwiązanie do ilościowej reakcji Real-Time PCR i dwuetapowej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych sond dla danej sekwencji. Może być stosowany w większości dostępnych termocyklerów PCR w czasie rzeczywistym.
Fast Probe qPCR Master Mix zawiera polimerazę Perpetual Taq DNA, zoptymalizowany bufor reakcyjny, dNTP (dTTP jest częściowo zastąpiony dUTP).
Perpetual Taq Polimeraza DNA zawiera rekombinowaną Taq polimerazę DNA związaną z przeciwciałami monoklonalnymi anty-Taq, które blokują aktywność polimerazy w umiarkowanych temperaturach. Aktywność polimerazy jest przywracana podczas początkowego etapu denaturacji, gdy reakcje amplifikacji są prowadzone w 95°C przez co najmniej dwie minuty. Zastosowanie enzymu „Hot Start” zapobiega wydłużaniu niewłaściwie przygotowanych produktów i struktur typu primer-dimer podczas reakcji. Zastosowanie Perpetual Taq DNA prowadzi do wyższej specyficzności i czułości reakcji PCR. Polimeraza umożliwia dogodne przygotowanie reakcji w temperaturze pokojowej.
Fast Probe qPCR Master Mix (2x) zawiera dUTP, który częściowo zastępuje dTTP. Umożliwia opcjonalne zastosowanie uracyl-N-glikozylazy (UNG), aby zapobiec zanieczyszczeniom między reakcjami. UNG usuwa uracyl z wszelkich zanieczyszczonych amplikonów zawierających dU, pozostawiając miejsca pozbawione zasad, czyniąc cząsteczki DNA podatnymi na hydrolizę podczas początkowego etapu denaturacji.
W przypadku zastosowania termocyklerów firmy Applied Biosystems i Stratagene konieczne jest zastosowanie pasywnego barwnika referencyjnego ROX. Fast Probe qPCR Master Mix (2x) jest dostarczany w dwóch wariantach: bez barwnika ROX oraz z barwnikiem ROX dostępnym oddzielnie. Barwnik ROX kompensuje zmiany sygnału fluorescencyjnego między studzienkami wynikające z niewielkich różnic w objętości reakcji. ROX nie bierze udziału w reakcji PCR, ma inne spektrum emisji niż SYBR Green I i nie zakłóca reakcji PCR w czasie rzeczywistym na żadnym termocyklerze. Poniższa tabela pokazuje zalecaną ilość barwnika ROX (25 µM) wymaganą dla konkretnego termocyklera.
