Ligaza T4 DNA katalizuje reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą fosforanową końca 5’ i hydroksylową końca 3’ DNA lub RNA. Katalizuje reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy fragmentami DNA o tępych końcach. Łączy kowalencyjnie fragmenty DNA z komplementarnymi końcami spójnymi. Uszczelnia przerwy (ang. nicks)  dsDNA, RNA lub w hybrydach DNA/RNA. Szczególnie polecana do przeprowadzania wydajnego klonowania fragmentów restrykcyjnych oraz łączenia tzw. linkerów i adaptatorów do tępych końców DNA.