Egzonukleaza I katalizuje usuwanie nukleotydów z jednoniciowego DNA w kierunku 3 '→ 5′. Nie degraduje dsDNA ani RNA. Jest aktywna w szerokim zakresie warunków buforowych. Egzonukleaza I jest idealna do: usuwania jednoniciowych starterów z reakcji PCR przed sekwencjonowaniem DNA lub analizą SNP, usuwania jednoniciowych starterów w reakcji „nested” PCR, usuwania ssDNA z dsDNA.