CviJI*

nr kat. E2126

Źródło: Chlorella virus IL-3A

5’-G C-3’
3’-C G-5’

z wyjątkiem

5’-Py G C Pu-3’
3’-Pu C G Py-5’

Enzym oczyszczony ze szczepu E.coli zawierającego plazmid ze sklonowanym genem cvijR (USA Patent nr US005472872A).

Temperatura reakcji: 37°C

Prototyp: CviJI*

Temperatura inaktywacji (20 min): 50°C

Opis:

CviJI* jest unikalną endonukleazą restrykcyjną rozpoznającą krótkie, 2-3 pz sekwencje DNA (1) i tnącą w ich obrębie. CviJI (Kat. nr E2125) rozpoznaje sekwencję 5′-PuGCPy-3′ i tnie pomiędzy G i C zostawiając tzw. tępe końce. W warunkach “star” (w obecności jonów magnezu, ATP i czynników stymulujących) CviJI* rozpoznaje i tnie sekwencje 5′-GC-3′, z wyjątkiem 5′-PyGCPu-3′. Wykazuje także aktywność względem jednoniciowego DNA, generując fragmenty restrykcyjne wielkości 20-200 pz.

Bufor do reakcji:

1x CviJI* Buffer: 20 mM glicylglicyna-KOH (pH 8.5), 10 mM octan magnezowy, 50 mM octan potasowy, 0.1 mM ATP, 0.1 mM ditiotreitol, 30% DMSO (bufor dostarczany wraz z enzymem jest 2 x stężony).

Definicja jednostki: Jedną jednostkę enzymu definiuje się jako taką jego ilość, jaka niezbędna jest do uzyskania stabilnego wzoru trawienia 1 µg pBR322 DNA w czasie 1 godziny. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 µl.

Warunki przechowywania: Przechowywać w –20°C.

Zastosowanie: Z uwagi na fakt, iż endonukleazy CviJI i CviJI* tną DNA z bardzo dużą częstotliwością, znalazły zastosowanie w nowych technikach biologii molekularnej (2,3,4). Restrykcja DNA o nieznanej sekwencji przez CviJI generuje dużą ilość fragmentów DNA, które przekształcone w oligonukleotydy po denaturacj termicznej, mogą być wykorzystane do:

  • mapowania dużych cząsteczek DNA lub sekwencjonowania DNA z wykorzystaniem oligonukleotydów jako anonimowych starterów,
  • mapowanie małych cząsteczek DNA z wysoką dokładnością,
  • cyklicznego znakowania DNA (ang. TCL, 4, Rys. 1),
  • detekcji (5),
  • amplifikacji (5),
  • klonowania (2,3),
  • mapowania epitopów,
  • konstruowania bibliotek genomowych z wykorzystaniem ang.shotgun cloning.

Dodatkowe informacje:

  • Endonukleaza restrykcyjna CviJI* podlega inhibicji w przypadku stężenia glicerolu wyższym niż 2.5%. W związku z powyższym polecamy raczej wydłużyć czas reakcji niż dodawać dodatkową porcję enzymu. Możliwe jest także przeprowadzenie powtórnego trawienia DNA, po jego uprzedniej precypitacji za pomocą etanolu.
  • Ponieważ miejsca rozpoznawane przez CviJI i CviJI* występują w DNA z wysoką częstotliwością, często obserwowane jest zjawisko sferycznej interferencji pomiędzy cząsteczkami enzymu, co powoduje iż niektóre z sekwencji rozpoznawanych trawione są z niższą wydajnością. W konsekwencji tego zjawiska rzadko można otrzymać fragmenty mniejsze niż 15 pz.
  • Ponieważ bufor reakcyjny zawiera DMSO, przed poddaniem trawienia analizie elektroforetycznej, polecamy precypitację DNA etanolem. Dodatek DMSO w żaden sposób nie przeszkadza w innych technikach dalszej manipulacji DNA jak ligacja czy znakowanie.

Kontrola jakości: Wszystkie preparaty endonukleaz restrykcyjnych sprawdzane są pod względem zanieczyszczenia niespecyficznymi endonukleazami i egzonukleazami. Równocześnie czystość preparatu oceniana jest testem ligacyjnym.

Literatura:
1. Xia,Y., Burbank, D., Uher, L., Rabussay, D. and Van Etten, J. Nucleic Acids Res.15, 6075–6090.
2.
Fitzgerald,M.C., Skowron, P., Van Etten, J.L., Smith, L.M. and Mead, D.A. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 3753–3762.
3.
Mead, D., Swaminathan, N., Van Etten J. and Skowron, P.M.: Recombinant CviJI restriction endonuclease. (1995) Unites States Patent no US005472872A.
4.
Skowron, P.M, Swaminathan, N., McMaster, K., George, D., Van Etten, J. and Mead, D. Gene 157 (1995) 37–41.
5.
Swaminathan, N., McMaster, K., Skowron, P. and Mead, D.A. Analytical Biochemistry 255 (1998) 133–141.