Triplex ASFV Fast qPCR Kit

nr kat. E0472

Produkt przeznaczony wyłącznie do użytku laboratoryjnego/weterynaryjnego, do diagnostyki in vitro.

Opis

  • Triplex ASFV Fast qPCR Kit jest przeznaczony do wykrywania DNA wirusa ASF (ang. African Swine Fever Virus) w krwi pełnej, surowicy, osoczu, wymazach (z jamy ustnej, nosa, nosogardzieli), próbkach tkanek, narządów świń oraz dzików.
  • Wysoka czułość zestawu pozwala na detekcję wirusa ASF zarówno w pojedynczych próbkach, jak i próbkach zmieszanych (pulowanych) w ilości maksymalnie 5 próbek indywidualnych.
  • Triplex ASFV Fast qPCR Kit umożliwia stosowanie standardowego lub szybkiego programu amplifikacji PCR zależnie od preferencji, używanego urządzenia real-time PCR.
  • Zestaw zawiera specyficzne startery dla wysoce konserwowanego fragmentu genu p72 wirusa ASF. Zamplifikowany fragment genu p72 jest wykrywany przy pomocy sondy znakowanej barwnikiem FAM.
  • Dodatkowo zestaw zawiera dwie kontrole, endo i egzogenną kontrolę wewnętrzną, na które składają się:
    1. startery i sonda znakowana barwnikiem HEX dla fragmentu świńskiego genu ACTB kodującego beta-aktynę (kontrola endogenna),
    2. startery, sonda znakowana barwnikiem Cy5 i egzogenny fragment kwasu nukleinowego – Ex-DNA (kontrola egzogenna).

Kontrole wewnętrzne umożliwiają weryfikację poprawności procesu izolacji DNA i reakcji PCR. Użycie egzogennej kontroli wewnętrznej pozwala dodatkowo na ocenę jakości próbki i możliwej inhibicji reakcji PCR.

  • Triplex ASFV Fast qPCR Kit pozwala na analizę próbek zarówno z użyciem egzogennej kontroli wewnętrznej Ex-DNA (analiza trójkanałowa: FAM, HEX, Cy5), jak i bez niej (analiza dwukanałowa: FAM i HEX). Zaleca się jednak dokonywanie analiz z użyciem egzogennej kontroli wewnętrznej. W celu analizy próbek z użyciem egzogennej kontroli wewnętrznej należy dodać Ex-DNA do buforu lizującego lub mieszaniny buforu lizującego i pobranej próbki (nie dodawać bezpośrednio do pobranej próbki) w ilości 0,1 μl na każdy 1 μl objętości elucji. Oznacza to, że w przypadku elucji buforem elucyjnym o objętości 50 μl należy zastosować 5 μl Ex-DNA w procesie izolacji DNA.
  • DNA do reakcji real time PCR powinno być dobrej jakości i oczyszczone przy pomocą dedykowanych, komercyjnie dostępnych zestawów wykorzystujących technologię złóż krzemionkowych lub kulek magnetycznych.
  • W skład Triplex ASFV Fast Master Mix wchodzą: Perpetual Taq polimeraza DNA, bufor reakcyjny, deoksynukleotydy (dNTPs), startery wraz z sondami do detekcji zamplifikowanych fragmentów DNA oraz barwnik referencyjny ROX.
  • Perpetual Taq Polimeraza DNA to enzym typu “hot start”, który jest blokowany w niskich temperaturach za pomocą przeciwciał, co umożliwia przygotowanie reakcji w temperaturze pokojowej. Aktywność polimerazy przywracana jest podczas 2-minutowego początkowego etapu denaturacji.
  • Barwnik referencyjny ROX zawarty w Triplex ASFV Fast Master Mix umożliwia normalizację fluorescencji w niektórych urządzeniach real-time PCR. Użycie barwnika referencyjnego ROX jest konieczne we wszystkich termocyklerach firmy Applied Biosystems i opcjonalne w przypadku termocyklerów firmy Agilent. ROX kompensuje zmiany sygnału fluorescencyjnego między dołkami z powodu niewielkich różnic w objętości reakcji i fluktuacji fluorescencji. Obecność barwnika ROX nie koliduje z PCR w czasie rzeczywistym na urządzeniach niewymagających tego barwnika referencyjnego.
  • Kontrola pozytywna — PC zawiera fragment DNA wirusa ASF, fragment świńskiego genu ACTB i egzogenny fragment kwasu nukleinowego – Ex-DNA. Reakcja kontroli pozytywnej pozwala na ocenę działania zestawu, w tym prawidłowego przygotowania reakcji PCR. Sygnał fluorescencji dla DNA wirusa ASF w kanale FAM posiada CT= 29±3, dla genu ACTB w kanale HEX posiada CT= 29±3, natomiast dla  kontroli egzogennej w kanale Cy5 posiada CT= 27±3.