Polimeraza DNA I jest mezofilną, DNA-zależną polimerazą DNA, wykazującą aktywność 3’→5′ oraz 5’→3′ egzonukleazy. Wykazuje aktywność polimeryzacyjną w kierunku 5’→3′. Może być stosowana do przygotowywania sond radioaktywnych i wykorzystywana do znakowania końców cząsteczek DNA o 3′ i 5′ „lepkich” lub „tępych” końcach.