Nukleaza S1 jest niespecyficzną endonukleazą, wykazującą aktywność głównie wobec jednoniciowego DNA i RNA. Enzym katalizuje degradację jednoniciowych kwasów nukleinowych do oligonukleotydów oraz 5′-mononukleotydów. Dwuniciowe DNA, dwuniciowe RNA i hybrydy DNA-RNA są odporne na degradację przy umiarkowanym stężeniu enzymu. S1 Nukleaza jest zdolna do degradacji dwuniciowych kwasów nukleinowych w miejscach niedopasowanych par zasad, w przerwach DNA (ang. gap) i w miejscach nacięć DNA (ang. nick).