T4 polimeraza DNA z faga T4, jest mezofilną polimerazą, wykazującą aktywność bardzo silnej egzonukleazy 3’→5′. Wymaga obecności startera oraz matrycy jednoniciowego DNA. Aktywność egzonukleolityczna, znacznie silniejsza niż w przypadku polimerazy DNA I, jest wyższa na matrycy jednoniciowego DNA aniżeli DNA dwuniciowego. Jako egzonukleaza może być wykorzystywana do usuwania jednego lub kilku nukleotydów z końca 3’ dwuniciowego DNA. Szczególnie polecana do: usuwania wystających fragmentów 3’, tworzenia “tępo” zakończonego DNA poprzez uzupełnianie brakującej nici od jej końca 5′, znakowania sond, przeprowadzając ang. replacement synthesis, przy użyciu wyznakowanych dNTP, generowania klonów delecyjnych, w mutagenezie miejscowo-specyficznej do syntezy drugiego łańcucha.