Egzonukleaza III jest egzonukleazą 3’→5′, uwalniającą 5′-mononukleotydy od strony końca 3′ łańcucha DNA. Wykazuje aktywność wobec dsDNA. Posiada aktywność 3′-fosfatazy DNA, hydrolizującej fosfomonoestry począwszy od końca 3′. Posiada aktywność endonukleazy AP, rozszczepiającej wiązania fosfodiestrowe szkieletu cukrowo-fosforanowego nici DNA w miejscach apurynowych (pozbawionych A lub G) lub apirymidynowych (pozbawionych T lub C) w sąsiedztwie brakującej zasady. Przygotowuje w ten sposób pole działania dla pozostałych enzymów naprawiających uszkodzone DNA. Posiada aktywność rybonukleazy H, degradującej nić RNA w hybrydach typu DNA-RNA. Enzym nie przeprowadza degradacji dsDNA, które posiada wystający koniec 3′ liczący więcej niż 4 zasady jednoniciowego DNA.